天然酶在輻射作用下失活，這對(duì)其在放射治療中的應(yīng)用構(gòu)成了巨大挑戰(zhàn)。在這種極端條件下，具有高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的單原子納米酶（SAzymes）成為替代天然酶縮小腫瘤的有希望的候選物質(zhì)。
在此，清華大學(xué)李亞棟院士，中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所晏亮副研究員和中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家研究中心付強(qiáng)特任研究員等人報(bào)道了一種以CuN3為中心的SAzyme（CuN3-SAzyme），其通過局部調(diào)節(jié)單個(gè)銅位點(diǎn)的配位環(huán)境，比以CuN4為中心的SAzyme表現(xiàn)出更高的過氧化物酶樣催化活性。
密度泛函理論計(jì)算顯示，CuN3活性分子具有最佳的H2O2吸附和解離特性，有助于提高 CuN3-SAzyme的酶活性。同時(shí)，X射線的引入可改善CuN3-SAzyme分解H2O2的動(dòng)力學(xué)，且CuN3-SAzyme在接受500 Gy總輻射劑量后非常穩(wěn)定，其幾何結(jié)構(gòu)和配位環(huán)境沒有發(fā)生顯著變化，同時(shí)仍保持著與天然酶相當(dāng)?shù)倪^氧化物酶樣活性。
此外，這種開發(fā)出來的CuN3-SA 酶具有顯著的抗輻射性，可用作外場(chǎng)改進(jìn)治療劑，用于增強(qiáng)體外和體內(nèi)的放射酶療法?？傊@項(xiàng)研究為開發(fā)通過局部配位操作提高酶活性并比天然酶具有更高抗放射性的SAzymes提供了一個(gè)范例，進(jìn)一步可用作癌癥治療的增敏劑。
相關(guān)文章以“Enhancing radiation-resistance and peroxidase-like activity of single-atom copper nanozyme via local coordination manipulation”為題發(fā)表在Nature Communications上。這也是李亞棟院士三天內(nèi)刊發(fā)的第二篇頂刊?。?/span>）
一般來說，天然酶暴露在X射線和γ射線等輻射下，其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生永久性改變，通過直接和間接作用在一定程度上導(dǎo)致失活。由于水占大多數(shù)生物組織成分的近80%，X射線可電離水分子，使氫氧鍵斷裂，產(chǎn)生一系列化學(xué)反應(yīng)物種。這些物質(zhì)會(huì)依次向天然酶的表面擴(kuò)散，通過化學(xué)反應(yīng)破壞酶的生化結(jié)構(gòu)。同時(shí)，X射線還能與天然酶的原子相互作用，導(dǎo)致一連串的物理和化學(xué)事件，最終引起酶的結(jié)構(gòu)變化甚至化學(xué)修飾。因此，X射線和γ射線對(duì)天然酶的滅活作用極大地阻礙了它們的各種應(yīng)用。因此，當(dāng)前研究的一個(gè)主要核心問題是開發(fā)具有優(yōu)異抗輻射能力和酶活性的人工酶，以解決天然酶的局限性，實(shí)現(xiàn)其在放療中的實(shí)際應(yīng)用。
納米酶表現(xiàn)出內(nèi)在的仿酶活性，結(jié)合了生物催化劑和納米材料的優(yōu)勢(shì)，具有超越天然酶的獨(dú)特能力，包括低成本、高穩(wěn)定性和易儲(chǔ)存。由于人工酶工程能夠在原子和分子水平上調(diào)控生物催化活性位點(diǎn)，人們從天然酶的結(jié)構(gòu)中獲得靈感，不斷設(shè)計(jì)出具有過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等酶活性的納米酶。迄今為止，從體外到體內(nèi)，人們一直致力于了解這些用于腫瘤診斷和治療的納米酶。特別是，與氧化銅（CuOx）納米顆粒相比，具有密集隔離的CuN4位點(diǎn)的銅SAzymes（CuN4-SAzyme）已被證明具有更高的過氧化物酶樣活性，但這種Cu-N4配位結(jié)構(gòu)對(duì)H2O2的吸附力仍然較弱，導(dǎo)致中間產(chǎn)物直接脫離。
圖1a是CuN3-SAzyme和CuN4-SAzyme的合成示意圖。以CuN3-SAzyme為例，KCl晶體為模板，與含有Cu(NO3)2和2-甲基咪唑的甲醇溶液混合形成Cu-MOFs層，將得到的前驅(qū)體在850℃煅燒2小時(shí)。TEM圖像顯示，CuN3-SAzyme具有典型的二維特征，表面原子般光滑（圖 1b），這與拉曼分析結(jié)果一致，而CuN4-SAzyme則具有多孔結(jié)構(gòu)的多面體形貌。同時(shí)，EDS圖譜分析表明，在CuN3-SAzyme和CuN4-SAzyme的整個(gè)結(jié)構(gòu)中，C、N和Cu元素的分布均勻一致。此外，還采用電感耦合等離子體光發(fā)射光譜（ICP-OES）對(duì)銅含量進(jìn)行了定量分析，CuN3-SAzyme的銅含量為2.98 wt%，CuN4-SAzyme的銅含量為1.21 wt%。
CuN3-SAzyme與CuN4-SAzyme的原子結(jié)構(gòu)比較
本文利用Cu K邊X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)（XAFS）光譜分析了CuN3-SAzyme和CuN4-SAzyme的化學(xué)狀態(tài)和配位環(huán)境。X射線吸收近邊結(jié)構(gòu)（XANES）光譜對(duì)中心金屬周圍的三維原子排列非常敏感，是識(shí)別原子構(gòu)型的有力工具。圖2a顯示了CuNx-SAzyme、CuOx納米酶和Cu K-edge XANES光譜。值得注意的是，CuN3-SAzyme和CuN4-SAzyme 的吸收邊位于 CuOx 納米酶的吸收邊之間。對(duì)于CuN3-SAzyme而言，吸收邊緣更接近于Cu2O納米酶的吸收邊緣，這表明原子分散的銅物種帶有正電荷，化合價(jià)接近+1。這一發(fā)現(xiàn)與CuN3-SAzyme 的Cu2p XPS光譜一致（圖2b）。
同時(shí)，圖2c顯示了CuNx-SAzymes的傅立葉變換擴(kuò)展Cu K-edge X 射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)（FT-EXAFS）光譜，CuN3-SAzyme和CuN4-SAzyme都在1.5 ?附近出現(xiàn)一個(gè)主峰，相當(dāng)于 Cu-N峰，在~2.3 ?處沒有明顯的峰，表明沒有Cu-Cu配位，這證實(shí)了沒有形成金屬結(jié)晶銅，只存在孤立的單個(gè)銅原子。進(jìn)一步采用EXAFS小波變換（WT）分析來區(qū)分反向散射原子，即使在R空間存在明顯重疊的情況下也是如此。如圖2g所示，CuN3-SAzyme的WT等值線圖在5 ?-1附近顯示出一個(gè)強(qiáng)度峰，表明銅原子和輕原子之間存在配位。
圖2：基于XAFS對(duì)CuN3-SAzyme的原子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。
評(píng)估CuN3-SAzyme過氧化物酶樣活性
受能夠改變SAzymes活性的化學(xué)微環(huán)境的啟發(fā)，作者接下來對(duì)CuNx-SAzymes的過氧化物酶樣活性進(jìn)行了評(píng)估和比較。計(jì)算得出的CuN3-SAzyme在pH值為3.54時(shí)的表觀比活度（11.33 U mg-1）比CuN4-SAzyme的表觀比活度（0.16 U mg-1）高出約71倍，比CuO納米酶的表觀比活度（0.91 U mg-1）高出12倍多，比Cu2O納米酶的表觀比活度（2.08 U mg-1）高出近5倍（圖3b）。相反，在相同條件下，不含銅的摻雜N的碳沒有顯示出明顯的催化性能。這些結(jié)果表明，調(diào)節(jié)Cu位點(diǎn)的配位結(jié)構(gòu)，特別是配位數(shù)，可以在數(shù)量級(jí)上提高過氧化物酶樣活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些納米酶遵循Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)，并確定了穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以定量比較了它們的催化特性。
為了研究CuN3-SAzyme的酶活性，作者進(jìn)行了DFT計(jì)算。研究發(fā)現(xiàn)，CuN3-SAzyme上的Cu單原子與H2O2分子之間存在很強(qiáng)的相互作用，使得H2O2的解離是一個(gè)無障礙過程，而CuN4-SAzyme的這種相互作用很弱，因此H2O2不能吸附在其上。同時(shí)，CuN3-SAzyme中的大部分Cu d態(tài)位于費(fèi)米級(jí)以下2 eV的能量范圍內(nèi)，并且d態(tài)在費(fèi)米級(jí)附近的單個(gè)Cu原子上有顯著分布。然而，對(duì)于CuN4-SAzyme上的單個(gè)Cu原子，其絕大多數(shù)d態(tài)位于費(fèi)米水平以下2 eV以外，費(fèi)米水平附近的Cu d態(tài)分布也較小。
此外，CuN3-SAzyme上的單個(gè)Cu原子突出于石墨烯平面2 ?以上，比CuN4-SAzyme上的面內(nèi)Cu原子更容易與H2O2結(jié)合。此外，圖4b顯示了在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)pH值（3.54和6.49）下H2O2分子在CuN3-SAzyme上解離的計(jì)算能量曲線。H2O2中O-O鍵的裂解和隨后H2O分子的形成對(duì)CuN3-SAzyme來說都是很容易發(fā)生的過程，這進(jìn)一步證明了其出色的酶活性。
圖4：CuN3-SAzyme過氧化物酶樣活性的DFT計(jì)算。
CuN3-SAzyme對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的協(xié)同抑制作用
由于CuN3-SAzyme具有放射增強(qiáng)過氧化物酶樣活性和顯著的光熱性能，作者將CuN3-SAzyme作為一種有效的治療藥物用于增強(qiáng)放射酶療法。在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，首先通過超聲波將CuN3-SAzyme切割并還原成微小的薄片，其平均流體力學(xué)直徑約為280 nm，Zeta 電位為-9.70 mV。CuN3-SAzyme可通過凝集素介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化到細(xì)胞中，并引發(fā)濃度依賴性死亡，對(duì)4T1細(xì)胞的半最大抑制濃度（IC50）為13.12 μg mL-1，對(duì)K7M2細(xì)胞的最大抑制濃度（IC50）為18.50 μg mL-1（圖5a）。相比之下，由于過氧化物酶樣活性較低，CuOx?納米酶和CuN4-SAzyme在相同的培養(yǎng)濃度下表現(xiàn)出較低的毒性。此外，CuN3-SAzyme對(duì)作為正常模型的細(xì)胞具有較高的IC50值（23.18 μg mL-1）。由此推斷，CuN3-SAzyme對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高效的選擇性抑制能力。
圖5：CuN3-SAzyme的體內(nèi)外增強(qiáng)放射酶治療。
綜上所述，作者通過調(diào)節(jié)局部配位數(shù)，制備了一種具有Cu-N3配位的單原子銅酶（CuN3-SAzyme）。與CuN4-SAzyme和CuOx納米酶相比，這種CuN3-SAzyme的酶活性和動(dòng)力學(xué)性能都要高得多。密度泛函理論（DFT）計(jì)算表明，設(shè)計(jì)的CuN3活性分子賦予 CuN3-SAzyme顯著的過氧化物酶活性。此外，當(dāng)暴露于輻射劑量高達(dá)500 Gy的X射線時(shí)，CuN3-SAzyme比天然過氧化物酶更穩(wěn)定。有趣的是，X射線的引入能增強(qiáng)CuN3-SA酶的過氧化物酶樣活性和動(dòng)力學(xué)特性。CuN3-SAzyme兼具卓越的抗輻射性和酶活性，可用于增強(qiáng)放射酶療法，解決天然酶應(yīng)用所面臨的關(guān)鍵問題。
Jiabin Wu, Xianyu Zhu, Qun Li, Qiang Fu, Bingxue Wang, Beibei Li, Shanshan Wang, Qingchao Chang, Huandong Xiang, Chengliang Ye, Qiqiang Li, Liang Huang, Yan Liang, Dingsheng Wang, Yuliang Zhao, Yadong Li,?Enhancing radiation-resistance and peroxidase-like activity of single-atom copper nanozyme via local coordination manipulation,?Nature Communications, https://doi.org/10.1038/s41467-024-50416-8
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