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研究背景

生物分子凝聚物 (biomolecular condensate) 是具有諸多生物功能的無膜細(xì)胞器，如細(xì)胞器形成、信號傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯。這些結(jié)構(gòu)被定義為“生物分子凝聚體”，它們的形成受到體內(nèi)組織、器官和生理環(huán)境的影響。然而，相分離失調(diào)時會導(dǎo)致病理性凝聚物的形成，從而會導(dǎo)致腫瘤疾病和神經(jīng)性等疾病。

雖然已經(jīng)確認(rèn)了許多蛋白質(zhì)具有相分離的能力并且能夠形成生物分子凝聚物，但在內(nèi)源水平上，對于哪些蛋白質(zhì)可以在生理?xiàng)l件下發(fā)生相分離，以及它們在這一過程中與何種伙伴相互作用仍然存在許多問題。

因此，科學(xué)家們迫切需要一種高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，以識別在某些生理事件中發(fā)生相分離或分配到凝聚物中的內(nèi)源性蛋白質(zhì)。然而，由于這些結(jié)構(gòu)在內(nèi)源水平上具有小而動態(tài)的結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜的成分，因此分離未知的生理液態(tài)/固態(tài)凝聚物并以蛋白質(zhì)組學(xué)的方式表征凝聚物蛋白仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

成果簡介

為了解決這一問題，華中科技大學(xué)生命學(xué)院劉筆鋒和李一偉教授等合作者聯(lián)合提出了一種新策略，旨在通過將蛋白質(zhì)在細(xì)胞中排序?yàn)椴煌墓丫蹜B(tài)來識別生物分子凝聚物并篩選其候選相分離蛋白質(zhì)。通過使用滲透壓壓縮輕微調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度和分子擁擠度，研究人員成功發(fā)現(xiàn)了1518個內(nèi)源表達(dá)水平的凝聚物蛋白質(zhì)，其中包括538個尚未被報道的凝聚物蛋白質(zhì)。

該方法有利于快速擴(kuò)展內(nèi)源性生物分子凝聚物的數(shù)據(jù)集，并能篩選出特異性響應(yīng)的候選相分離蛋白質(zhì)。這項(xiàng)研究成果在線發(fā)表在Nature Chemistry雜志上，題為“High-throughput and proteome-wide discovery of endogenous biomolecular condensates”，引起了廣泛關(guān)注！

圖文導(dǎo)讀

為了高通量識別生物分子凝聚物，研究者在圖1a中首先使用了蔗糖密度梯度超速離心的方法，將細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)按照其密度分離出來，隨后利用定量質(zhì)譜技術(shù)對不同密度梯度分?jǐn)?shù)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了檢測和識別。研究者通過這一步驟識別出了具有不同的寡聚蛋白質(zhì)，作為生物分子凝聚物的成分，以及候選的相分離蛋白質(zhì)。在圖1b中，研究者采用了滲透壓壓縮的方法來動態(tài)擾動相分離蛋白質(zhì)的程度。通過使用高滲介質(zhì)（含有5%聚乙二醇（PEG）300）來減小細(xì)胞的體積，研究者實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞濃度的增加和分子擁擠度的提高。這種操作使得相分離蛋白質(zhì)的聚態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)一步幫助識別生物分子凝聚物的組分。

圖1. 生物分子凝聚物高通量識別的示意圖。

在圖2中，研究者進(jìn)行了高通量鑒定相分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)。圖中分為多個部分，其中a部分展示了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)顯示了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的良好相關(guān)性。b部分顯示，在8,425種檢測到的蛋白質(zhì)中，有1,050種被確定為生物分子凝聚物（BMCs）中的蛋白質(zhì)。其中625種已經(jīng)在PhaSepDB數(shù)據(jù)庫中報道為相分離蛋白質(zhì)，而剩余的425種被確定為尚未報道的相分離候選蛋白質(zhì)。c部分展示了在每個分?jǐn)?shù)中檢測到的新蛋白質(zhì)和新發(fā)現(xiàn)的候選蛋白質(zhì)的數(shù)量。d部分顯示了11種已知無膜細(xì)胞器中各個分?jǐn)?shù)中檢測到的蛋白質(zhì)數(shù)量，提示了蛋白質(zhì)的寡聚態(tài)分布。e部分表明，來自不同寡聚態(tài)的內(nèi)源相分離蛋白質(zhì)包含不同的結(jié)構(gòu)域和屬于不同的家族?？傊?，這些結(jié)果顯示，使用這種高通量方法可以有效地識別和鑒定生物分子凝聚物和相分離蛋白質(zhì)。

圖2. 相分離蛋白高通量識別。

圖3的實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證候選凝聚物蛋白的相分離行為。其中，在a部分作者通過體積壓縮驗(yàn)證了內(nèi)源性表達(dá)的凝聚物蛋白。b部分顯示了在體積壓縮下蛋白質(zhì)的寡聚態(tài)分布發(fā)生了轉(zhuǎn)移，其中第六個分?jǐn)?shù)的蛋白質(zhì)寡聚態(tài)發(fā)生了顯著變化。c部分顯示，在第六個分?jǐn)?shù)中總共確定了141種蛋白質(zhì)為內(nèi)源性凝聚物蛋白，其中112種已被報道，而29種是新發(fā)現(xiàn)的。為了驗(yàn)證報道的112種蛋白質(zhì)，作者選擇了兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，PRDX1和YBX1，結(jié)果顯示它們在體積壓縮下形成的凝聚物結(jié)構(gòu)更大。同時，熒光免疫染色結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了它們的凝聚狀態(tài)。

此外，對四種新發(fā)現(xiàn)的凝聚物蛋白質(zhì)（MTDH、ZNF431、MRPL23和TOE1）進(jìn)行了進(jìn)一步研究，結(jié)果顯示它們在細(xì)胞內(nèi)形成了類似斑點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，并且在活細(xì)胞成像中觀察到了這些結(jié)構(gòu)的融合和分裂。FRAP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這些蛋白在結(jié)構(gòu)內(nèi)的動態(tài)交換。這些發(fā)現(xiàn)為作者理解細(xì)胞內(nèi)凝聚物蛋白的相分離行為提供了重要證據(jù)，同時也為凝聚物的功能和機(jī)制研究提供了新的視角。

圖3. 通過體積壓縮識別的凝聚物蛋白的驗(yàn)證。

圖4是驗(yàn)證其技術(shù)能否鑒定與轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路相關(guān)的生物分子凝聚物。為此，他們對H1975細(xì)胞進(jìn)行了短期（40分鐘）或長期（兩天）的TGF-β處理，并進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。

圖4a中展示了研究者識別內(nèi)源性凝聚物蛋白的方法示意圖。b部分展示了在短期TGF-β處理下蛋白寡聚態(tài)分布的變化變化情況。c部分展示了在短期TGF-β處理下鑒定的50種凝聚物蛋白。這些蛋白中，92%（46/50）與TGF-β信號通路相關(guān)，包括在TGF-β誘導(dǎo)的無膜細(xì)胞器中發(fā)現(xiàn)的蛋白、調(diào)節(jié)TGF-β受體/共受體的蛋白、TGF-β下游調(diào)控蛋白和調(diào)節(jié)TGF-β信號通路上游的蛋白等。

此外，研究者還驗(yàn)證了一些已知蛋白（如EMD和PCNA）以及一些新發(fā)現(xiàn)的蛋白（如NCEH1、NAMPT、ASNS和LTA4H）在TGF-β處理后的凝聚物形成行為。通過這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者成功地鑒定了TGF-β信號通路中參與的凝聚物蛋白，并且提供了更多有關(guān)這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制的信息。

圖4. 對TGF-β短期處理的凝聚物蛋白的識別。

在圖5中他們觀察到不同干擾條件下識別的蛋白質(zhì)模式有所不同。通過對蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行分類，研究人員發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)涉及不同的生物過程。在壓縮條件下識別的凝聚物蛋白主要與翻譯和轉(zhuǎn)錄相關(guān)（見圖5b），而在短期TGF-β刺激條件下觀察到的蛋白則與Wnt平面細(xì)胞極性（PCP）信號和經(jīng)典信號的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)（見圖5c）。

另一方面，長期TGF-β刺激引發(fā)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）導(dǎo)致凝聚物蛋白模式的擴(kuò)展和變化，涉及到更多的生物過程，如點(diǎn)粘附、RNA結(jié)合、緊密連接和Hippo信號傳導(dǎo)（見圖5d）。通過富集分析，他們發(fā)現(xiàn)這些凝聚物蛋白可能參與調(diào)節(jié)其他重要的生物過程，如成骨細(xì)胞分化、腫瘤壞死因子信號、白細(xì)胞介素17信號、肥厚型心肌病和心肌收縮。這些發(fā)現(xiàn)為作者提供了深入了解相分離蛋白在細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)過程中的作用的見解，并為進(jìn)一步研究這些蛋白的功能和調(diào)節(jié)提供了重要線索。

圖5. 內(nèi)源表達(dá)相分離蛋白的蛋白組學(xué)分析。

總結(jié)展望

本文展示了一種創(chuàng)新的高通量策略，可用于在蛋白質(zhì)組水平上識別內(nèi)源性生物分子凝聚物，并篩選參與相分離的蛋白質(zhì)。通過結(jié)合體積壓縮和TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程，研究人員揭示了大量內(nèi)源性蛋白質(zhì)對相分離的響應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)了一系列之前從未報道過的潛在凝聚物形成蛋白質(zhì)。

此外，研究人員的方法還揭示了細(xì)胞體積變化對蛋白質(zhì)相分離狀態(tài)的影響，進(jìn)一步證明了分子擁擠在細(xì)胞內(nèi)物理/機(jī)械調(diào)控中的重要性。最重要的是，該研究為量化和內(nèi)源性蛋白質(zhì)組學(xué)提供了一種全新的方法，這將極大地促進(jìn)對生物分子凝聚物和相分離的深入理解，從而推動基礎(chǔ)生物學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展。

文獻(xiàn)信息

Li, P., Chen, P., Qi, F. et al. High-throughput and proteome-wide discovery of endogenous biomolecular condensates. Nat. Chem. (2024).

原創(chuàng)文章，作者：計(jì)算搬磚工程師，如若轉(zhuǎn)載，請注明來源華算科技，注明出處：http://m.xiubac.cn/index.php/2024/05/06/c716baeeb3/

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