自2007年發(fā)現(xiàn)Fe?O?納米粒子的類酶活性以來，納米酶以其催化活性高、成本低、反應(yīng)條件溫和、穩(wěn)定性好及適合大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，成為天然酶最具潛力的替代品。近年來，隨著納米醫(yī)學(xué)和納米催化的交叉融合，基于納米酶的治療策略引起了人們的極大關(guān)注，因?yàn)槊复呋磻?yīng)可以在腫瘤微環(huán)境中觸發(fā)，達(dá)到良好的治療效果，具有底物特異性和低副作用的優(yōu)點(diǎn)。本文綜述了納米酶的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展簡(jiǎn)史，討論了納米酶的分類及其催化機(jī)理。并重點(diǎn)介紹了密度泛函理論、機(jī)器學(xué)習(xí)、仿生和化學(xué)設(shè)計(jì)等方法對(duì)納米酶活性的預(yù)測(cè)和理性設(shè)計(jì)。然后，介紹了納米酶的協(xié)同治療策略。最后，概述了納米酶用于腫瘤治療的當(dāng)前挑戰(zhàn)和未來前景，包括選擇性、生物安全性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、催化機(jī)制、活性預(yù)測(cè)和評(píng)估。

2. 重點(diǎn)介紹了納米酶的活性預(yù)測(cè)和理性設(shè)計(jì)方法，包括密度泛函理論、機(jī)器學(xué)習(xí)、仿生和化學(xué)設(shè)計(jì)。

I 納米酶的分類和催化機(jī)制研究

圖1. (a)天然HRP和(b)金屬氧化物納米酶的催化反應(yīng)路線圖；(c,d)類POD納米酶的催化機(jī)制；(e)基于標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位的普魯士藍(lán)納米粒子的多重酶活性和催化機(jī)制示意圖。

OXD通過有效和選擇性利用O?在需氧生物進(jìn)化中的關(guān)鍵作用而備受關(guān)注，O?是一種容易獲得且對(duì)環(huán)境無(wú)害的氧化劑。眾所周知，生物圈中大部分O?消耗是由血紅素-銅氧化酶的家族催化的，例如細(xì)胞色素c氧化酶。同時(shí)，OXD在制藥、食品、生物技術(shù)等行業(yè)X有著廣泛的應(yīng)用。OXD在O?(電子受體)存在下可以催化底物(電子供體)氧化為相應(yīng)的氧化產(chǎn)物，同時(shí)產(chǎn)生H?O或H?O?。最近，許多無(wú)機(jī)納米材料被發(fā)現(xiàn)在O?的幫助下可催化一種或多種底物的氧化，表現(xiàn)出類OXD活性，如鈰基氧化物、貴金屬(Au、Pt和Pd等)、錳基氧化物、MOFs等。并根據(jù)底物被氧化基團(tuán)對(duì)類OXD納米酶進(jìn)行了分類，如類多酚氧化酶、類葡萄糖氧化酶(類GO?)、類細(xì)胞色素C氧化酶、類亞硫酸鹽氧化酶等。具有類OXD活性的納米酶催化底物的氧化過程，并且伴隨電子轉(zhuǎn)移催化過程可以通過溫度、pH和底物進(jìn)行調(diào)節(jié)。他們的反應(yīng)也遵循Michaelis–Menten動(dòng)力學(xué)。

CAT是人體中最重要的氧化還原酶之一。CAT可以催化H?O?分解成H?O分子和O?，在催化去除活性氧物種(ROS)、防止細(xì)胞膜損傷和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面起著至關(guān)重要的作用。另外，CAT是過氧化物酶的一種標(biāo)志酶，約占過氧化物酶體酶總量的40%，廣泛存在于細(xì)胞的過氧化物酶體內(nèi)。但在實(shí)際應(yīng)用中，具有天然酶固有的穩(wěn)定性差、保存困難等缺點(diǎn)。應(yīng)運(yùn)而生的納米酶也被用來模擬CAT活性。迄今為止，金屬、金屬氧化物、MOFs、碳基納米材料、金屬硫化物和普魯士藍(lán)等材料被先后證明具有類CAT酶活性，并在腫瘤治療、免疫檢測(cè)等方面被廣泛運(yùn)用。探索內(nèi)在催化機(jī)理對(duì)于開發(fā)類CAT納米酶是必要的。基于密度泛函理論(DFT)計(jì)算，研究者們開展了一系列理論研究，探索類CAT納米酶的催化機(jī)理。事實(shí)證明，不同的類CAT納米酶具有不同的催化機(jī)理。一般來說，H?O?有兩種類型的化學(xué)鍵，即H?O鍵和O?O鍵。根據(jù)H?O?不同的鍵斷裂方式，可以將類CAT納米酶的催化機(jī)制歸納為異裂反應(yīng)和均裂反應(yīng)兩類。

SOD是一組金屬酶，可催化O?·?歧化為H?O?和O?。天然SOD存在于大多數(shù)原核細(xì)胞和一些真核細(xì)胞中，并且廣泛存在于各種細(xì)胞器中。根據(jù)不同的輔因子，天然SOD酶分為錳SOD(MnSOD)、鐵SOD(FeSOD)、銅鋅SOD(CuZnSOD)和鎳SOD(NiSOD)四種類型。作為對(duì)抗ROS介導(dǎo)損傷的第一道防線，SOD有望在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的治療中發(fā)揮重要作用。然而，SOD的臨床應(yīng)用受到其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性和高成本的嚴(yán)重限制。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約100種納米酶表現(xiàn)出類SOD的活性，其中富勒烯和CeO?是最廣為人知的。

水解酶是催化水解反應(yīng)的一類酶的總稱，也可以說它們是一類特殊的轉(zhuǎn)移酶，用水作為被轉(zhuǎn)移基團(tuán)的受體。水解酶可以催化一系列獨(dú)特化學(xué)鍵的水解。例如，核酸酶可以裂解多核苷酸鏈的磷酸二酯鍵，酯酶能將酯水解為酸和醇。水解納米酶是具有類似水解酶活性的納米材料，根據(jù)水解底物的不同分為核酸酶、酯酶、磷酸酶、蛋白酶等。近年來，已經(jīng)報(bào)道了大量的水解納米酶，例如膠束，囊泡和納米顆粒。膠束和囊泡的狀態(tài)在很大程度上取決于溶劑的性質(zhì)、溶液的離子強(qiáng)度和添加劑的存在，然而對(duì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和催化位點(diǎn)的控制有限。而對(duì)于納米顆粒，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和催化位點(diǎn)可以得到很好的控制。

II  納米酶的活性預(yù)測(cè)及合理設(shè)計(jì)

由于納米材料的成分復(fù)雜且催化位點(diǎn)模糊，因此缺乏對(duì)顆粒與納米酶活性之間關(guān)系的基本了解。如何有效設(shè)計(jì)納米酶是該領(lǐng)域急需解決的關(guān)鍵問題之一。目前，在納米酶的設(shè)計(jì)和合成中，通常使用經(jīng)驗(yàn)和“試錯(cuò)”方法。制備所需特征納米酶通常需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并且成功率極大依賴于研究人員的直覺和經(jīng)驗(yàn)，且采用“試錯(cuò)”方法制備的類POD納米酶的活性通常較低，一般比HRP低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，如何有效設(shè)計(jì)納米酶對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)大研究和促進(jìn)實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。目前為止，已經(jīng)開發(fā)了多種有效設(shè)計(jì)納米酶的策略，主要包括DFT、機(jī)器學(xué)習(xí)、仿生設(shè)計(jì)和化學(xué)設(shè)計(jì)。

納米材料的優(yōu)異特性豐富了納米酶活性調(diào)控手段，同時(shí)伴隨著納米合成技術(shù)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)制備的納米酶數(shù)量不斷增加，而如何從如此龐大的材料庫(kù)里高效獲得高性能納米酶成為一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。近年來，計(jì)算機(jī)輔助的高通量篩選成為較為熱門及有效的篩選手段，可從大量材料中對(duì)其特定性能進(jìn)行快速評(píng)價(jià)，從而篩選出所需材料。作為人工智能的一個(gè)分支，機(jī)器學(xué)習(xí)旨在開發(fā)計(jì)算算法，以基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)推斷數(shù)學(xué)模型，這為加速開發(fā)所需的納米顆粒提供了一種有前途的工具。鑒于納米酶的復(fù)雜性和多樣性。圖2介紹了機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)納米酶過程示意圖。

科研工作者提出了一種計(jì)算輔助的類POD納米酶篩選和設(shè)計(jì)的通用方法，用于“從頭”預(yù)測(cè)類POD納米酶的催化活性。該方法主要采用密度泛函方法對(duì)類POD納米酶進(jìn)行高通量計(jì)算。研究者以最早的氧化鐵類POD納米酶為模型，構(gòu)建了多種具有不同化學(xué)組成、晶格缺陷、暴露晶面和化學(xué)修飾的納米氧化鐵表面。此外，研究這些表面在模擬類POD催化H?O?分子氧化有機(jī)底物的分子機(jī)理和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，總結(jié)該類催化反應(yīng)的機(jī)制特征。其次，基于化學(xué)反應(yīng)原理進(jìn)行近似處理和推導(dǎo)，導(dǎo)出預(yù)測(cè)氧化鐵類POD活性的能量描述符、火山型曲線和催化活性窗口。目前，已經(jīng)對(duì)57種金屬、單金屬氧化物、鈣鈦礦和碳材料進(jìn)行了計(jì)算驗(yàn)證，證明該模型可適用于其他遵循類似催化機(jī)制的類POD納米酶。證實(shí)了高通量計(jì)算篩選可實(shí)現(xiàn)納米酶高效設(shè)計(jì)，加快納米酶領(lǐng)域的研究，并對(duì)實(shí)驗(yàn)具有一定的指導(dǎo)意義。

近年來，很多研究嘗試將天然酶的核心催化元件通過仿生模擬的手段嫁接至納米酶的結(jié)構(gòu)中。許多為天然酶提供高催化活性的因素已經(jīng)被研究者們用來指導(dǎo)納米酶的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，例如仿生結(jié)合位點(diǎn)、組成、配位化學(xué)以及缺陷工程，合成了一系列具有高效催化活性的納米酶。一些仿生手段開發(fā)的納米酶的催化活性接近甚至超過天然酶。目前，通過生物啟發(fā)策略理性設(shè)計(jì)高活性納米酶已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。通常，天然酶可以高活性和選擇性有效地催化底物的化學(xué)反應(yīng)。天然酶活性中心附近的結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)和組成提供了有利的疏水空間微環(huán)境，這對(duì)于高催化效率尤為重要。特別是，結(jié)合口袋中的一些氨基酸位于天然酶的催化活性位點(diǎn)附近，可以通過非共價(jià)相互作用幫助富集、組織和激活底物。受這些獨(dú)特功能的啟發(fā)，人們?cè)O(shè)想通過修飾特定的氨基酸和構(gòu)建有利的空間結(jié)構(gòu)來定制活性位點(diǎn)周圍的催化微環(huán)境，這可能是構(gòu)建催化活性更接近天然酶的納米酶的一種有前途的策略。Fe?O?納米材料已被廣泛報(bào)道具有類似過氧化物酶的活性，在于表面有大量的三價(jià)鐵和二價(jià)鐵，其催化方式類似于HRP活性位點(diǎn)中的血紅素基團(tuán)。催化動(dòng)力學(xué)分析表明，F(xiàn)e?O?對(duì)底物的催化效率與HRP相當(dāng)，但與底物結(jié)合的能力遠(yuǎn)低于HRP。

圖2. 機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)納米酶過程示意圖。(a)從收集數(shù)據(jù)庫(kù)到網(wǎng)絡(luò)資源DiZyme開發(fā)示意圖；(b-e)多種人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方案示意圖；(f)源自920條數(shù)據(jù)的內(nèi)部影響因素和外部影響因素分布圖；(g)定量模型預(yù)測(cè)的類POD和類OXD活性的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果。

III  納米酶用于體內(nèi)療效診斷

圖3.  (a)DOx-CACN用于可切換MRI精確監(jiān)測(cè)鐵死亡相關(guān)協(xié)同治療機(jī)制示意圖；(b,c) DOx-CACN產(chǎn)生的ROS和釋放的DOx量與MRI信號(hào)的關(guān)系圖；(d,e) DOx-CACN的體內(nèi)熒光和MRI檢測(cè)結(jié)果；(f)可監(jiān)測(cè)1?F/1H-MRI信號(hào)的PFOB@MnO?用于診療一體化過程示意圖；(g)小鼠體內(nèi)的T1-MRI和1?F-MRI檢測(cè)結(jié)果；(h) MSPN的NIRF-PA成像功能用于類OXD活性檢測(cè)過程示意圖；(i, j)體內(nèi)的歸一化熒光強(qiáng)度比和PA比。

IV  納米酶用于多模式抗癌治療研究

在生物體中，許多生化過程通過一系列酶促反應(yīng)以級(jí)聯(lián)方式在細(xì)胞中同時(shí)發(fā)生來完成生命活動(dòng)過程。生物系統(tǒng)中的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)由于擴(kuò)散勢(shì)壘降低、中間體的局部濃度高和傳質(zhì)效率高，可以有效提高酶反應(yīng)的催化性能。然而，由于天然酶自身固有的缺陷，酶串聯(lián)反應(yīng)體系表現(xiàn)出反應(yīng)條件嚴(yán)格、穩(wěn)定性差等局限性，阻礙了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。納米酶作為酶的替代品，不同的納米酶具有不同的類酶活性，通過不同方式將多種納米酶集成到一個(gè)平臺(tái)，構(gòu)建的級(jí)聯(lián)催化體系，可有效提高催化效率。另外，某些納米酶本身能夠模擬多種不同的酶活性，為構(gòu)建仿生自級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系提供了新機(jī)遇。級(jí)聯(lián)途徑通常遵循一種酶的反應(yīng)產(chǎn)物作為另一種酶的底物的順序方式。例如，GO?或類GO?納米酶可以通過催化腫瘤內(nèi)葡萄糖產(chǎn)生顯著的H?O?分子來引發(fā)反應(yīng)，隨后的納米酶參與的催化反應(yīng)以H?O?分子為底物通過類POD活性催化產(chǎn)生·OH，毒性的·OH可用于抗腫瘤治療或者生物傳感。

基于這個(gè)背景，近年來越來越多的級(jí)聯(lián)納米診療體系被開發(fā)，用以放大腫瘤效果。陳春英等設(shè)計(jì)了一種酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)及超聲介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)納米催化劑(BTO/MoS?@CA)(圖4a-c)，通過將pH響應(yīng)性肉桂醛(CA)釋放介導(dǎo)的、自供應(yīng)H?O?及正負(fù)電荷增強(qiáng)的酶活性整合在一起，表現(xiàn)出卓越的特異性和協(xié)同性的腫瘤治療效果。此外，陳雨等人報(bào)道了一種以鈣鈦礦納米晶體為基底的超聲增強(qiáng)酶動(dòng)力治療策略(圖4d-f)。考慮到多酶催化反應(yīng)需要高水平的H?O?充當(dāng)?shù)孜?，但腫瘤微環(huán)境中H?O?含量不足以實(shí)現(xiàn)理想的治療效果，引入GO?并在級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)過程中充當(dāng)酶動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)物，作為腫瘤特異性H?O?生成器。此外，外源性超聲可以通過加速中間復(fù)合物向Fe(II)的轉(zhuǎn)換速率來促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析、ELISA試劑盒評(píng)估和蛋白質(zhì)印跡分析證明產(chǎn)生的ROS可通過ROS-TXNIP-NLRP3-GSDMD通路誘導(dǎo)焦亡。

圖4. (a) BTO/MoS?@CA的合成及壓電催化機(jī)理示意圖；(b，c)采用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法分析BTO/MoS?@CA濃度對(duì)ROS生成量和GPX4表達(dá)情況的影響；(d)LFO@GO?的合成過程和超聲增強(qiáng)的酶催化治療機(jī)理示意圖；(e)環(huán)形熱圖；(f)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

V 結(jié)論和展望

近年來，納米酶以其高催化活性、溫和的反應(yīng)條件、良好的穩(wěn)定性以及納米材料的物理化學(xué)性質(zhì)引起了研究人員的廣泛關(guān)注，并用于抗癌治療策略探索?？梢愿鶕?jù)實(shí)際需求，將納米酶運(yùn)輸?shù)较鄳?yīng)的細(xì)胞微環(huán)境中，發(fā)揮作用。因此，基于腫瘤微環(huán)境獨(dú)特的生理環(huán)境和代謝產(chǎn)物，設(shè)計(jì)具有腫瘤特異性治療和診斷功能的多功能納米酶具有廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用前景。未來的研究可基于以下幾個(gè)方面進(jìn)行。

(1) 納米酶的催化機(jī)理和關(guān)鍵催化位點(diǎn)需要深入分析。目前，對(duì)納米酶的研究大多集中在優(yōu)化催化活性上，對(duì)催化機(jī)理的分析較少。此外，除了少數(shù)單原子納米酶外，很少有報(bào)道揭示納米酶的催化位點(diǎn)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)信息。

(2) 需要對(duì)DFT和機(jī)械學(xué)習(xí)開展進(jìn)一步的研究，以預(yù)測(cè)和評(píng)估納米酶的活性。盡管使用了理論計(jì)算等方法預(yù)測(cè)納米酶的催化路徑，但很少有研究能夠結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來解釋納米酶的催化機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系。

(3) 納米酶通常具有多種酶活性，而不同酶活性之間的關(guān)系、相互影響、增強(qiáng)或抑制方法以及原因需要解決。如何提高納米酶催化特定底物或一類類似物的選擇性？該研究對(duì)只需要單一酶活性的應(yīng)用領(lǐng)域具有重要意義。

(4) 對(duì)于癌癥的診斷和治療，揭示腫瘤微環(huán)境與納米酶的催化效率和選擇性之間的關(guān)系是非常重要的。此外，需要揭示納米酶在生物環(huán)境中的活性和選擇性調(diào)節(jié)方式，因?yàn)榇蠖鄶?shù)納米酶的活性在生物環(huán)境中被抑制。目前，內(nèi)在的結(jié)構(gòu)工程(如摻雜和缺陷工程)和外部觸發(fā)因素(如溫度、超聲、光和小分子)已被用于生物環(huán)境中納米酶的活性調(diào)節(jié)。然而，深入細(xì)致的調(diào)控策略仍需深入探索。

(5) 納米酶的生物安全性需要進(jìn)一步探索。一方面，與其他納米材料類似，納米酶的毒理學(xué)研究，包括長(zhǎng)期細(xì)胞毒性、給藥、代謝、排泄、生物分布、藥代動(dòng)力學(xué)、大型動(dòng)物的藥效學(xué)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等仍未得到證實(shí)。另一方面，對(duì)于催化治療效果，納米酶的靶向性、選擇性、特異性、體內(nèi)活性和定位仍不清楚。體內(nèi)微環(huán)境復(fù)雜，因此納米酶在體內(nèi)的催化路徑往往是不可控的。同時(shí)，潛在的體內(nèi)生物催化反應(yīng)和生物界面的機(jī)制也很難預(yù)測(cè)，所有這些都將成為影響生物安全的因素。因此，需要對(duì)納米酶的體內(nèi)穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)(如攝取、分布和代謝)、治療效果的持續(xù)時(shí)間和毒性(如溶血和凝血分析)進(jìn)行系統(tǒng)的研究和分析。

(6)納米酶的協(xié)同治療策略已被廣泛報(bào)道，而不同治療模式之間的相互影響、促進(jìn)和協(xié)同機(jī)制需要利用新技術(shù)和手段進(jìn)行深入驗(yàn)證。

(7) 納米酶催化活性的重復(fù)性和穩(wěn)定性有待研究。多數(shù)報(bào)道集中在新納米酶的發(fā)現(xiàn)上，而很少有關(guān)于穩(wěn)定性等的驗(yàn)證研究。這些問題的解決有望加速納米酶的工業(yè)應(yīng)用。

(8) 闡明治療分子機(jī)制的多種組學(xué)分析方法需要深入探索。應(yīng)致力于在不同分子水平上進(jìn)行多組學(xué)分析，如基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、表觀基因組、代謝組和微生物組，以獲得相關(guān)的組學(xué)數(shù)據(jù)，更深入地了解治療過程中各種分子之間的調(diào)節(jié)和因果關(guān)系。

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